Estudo funcional da proteína quinase JNK de Schistosoma mansoniatravés de expressão heteróloga no organismo modelo Caenorhabditis elegans / Functional studies of the protein kinase JNK Schistosoma mansoni by heterologous expression in the model organism C. elegans

A identificação e caracterização dos mecanismos e moléculas envolvidos em sinalização celular são essenciais para o entendimento da biologia parasitária do S. mansoni. Proteína quinases desempenham papel chave em vias de sinalização e tem sido propostas como potenciais alvos para o desenvolvimento de novas drogas anti-Schistosoma. Visto que a caracterização funcional em S. mansoni é dificultada por limitações nos métodos de transformação genética deste parasito, o presente estudo propõe o uso de C. elegans como um modelo para a expressão heteróloga de genes de S. mansoni que codificam proteínas quinases. Genes que codificam proteína quinase sem S. mansoni,homólogos aos identificados em C. elegans, foram selecionados pelo nosso grupo a partir do proteoma do parasito através de uma abordagem filogenômica. Inicialmente, foi selecionada a proteína quinase JNK, que participa da via de sinalização das MAP quinases para a realização das análises experimentais. Em C. elegans, a proteína JNK está relacionada ao aumento de longevidade e da resistência aos estresses térmico e oxidativo. Oligonucleotídeos específicos foram desenhados paraamplificar a região promotora do gene emC. elegansbem como as regiões codificantes(CDS) em ambos os organismos. A região promotora foi amplificada a partir do DNAgenômico extraído deC. elegansadultos. O RNA total foi extraído de esquistossômuloseC. elegansadultos. As CDS foram amplificadas a partir do cDNA sintetizado e osfragmentos de DNA resultantes foram clonados emE. coliDH5α. As construçõesobtidas foram digeridas com enzimas de restrição selecionadas de forma a linearizar ovetor contendo a região promotora e recuperar as CDS. Posteriormente, foramrealizadas subclonagens através da ligação das CDS deC. eleganseS. mansonicom aconstrução contendo a região promotora.C. elegansN2 receberam as construçõesfinais através de microinjeção. Foram obtidas três linhagens que expressam Ce_JNK-1,denominadas N2Ex01[Ce_jnk-1], N2Ex02[Ce_jnk-1]e N2Ex03[Ce_jnk-1]e duaslinhagens expressando Sm_JNK, denominadas N2Ex04[Sm_jnk]e N2Ex05[Sm_jnk].Os níveis de expressão de Sm_JNK e Ce_JNK-1 nas linhagens transgênicas foramavaliados por RT-PCR quantitativo. Apesar do aumento da expressão de JNKobservado nas linhagens transgênicas, não houve aumento na longevidade dasmesmas. Embora esta seja a primeira utilização de expressão heteróloga emC. eleganspara investigar a função de genes deS. mansoni, esta técnica tem sido utilizada comsucesso para nematóides parasitos e pode tornar-se uma abordagem alternativa para osestudos funcionais em outros parasitos.

Estudo funcional da proteína quinase JNK de Schistosoma mansoniatravés de expressão heteróloga no organismo modelo Caenorhabditis elegans

A identificação e caracterização dos mecanismos e moléculas envolvidos em sinalização celular são essenciais para o entendimento da biologia parasitária do S. mansoni. Proteína quinases desempenham papel chave em vias de sinalização e tem sido propostas como potenciais alvos para o desenvolvimento de novas drogas anti-Schistosoma. Visto que a caracterização funcional em S. mansoni é dificultada por limitações nos métodos de transformação genética deste parasito, o presente estudo propõe o uso de C. elegans como um modelo para a expressão heteróloga de genes de S. mansoni que codificam proteínas quinases. Genes que codificam proteína quinase sem S. mansoni,homólogos aos identificados em C. elegans, foram selecionados pelo nosso grupo a partir do proteoma do parasito através de uma abordagem filogenômica. Inicialmente, foi selecionada a proteína quinase JNK, que participa da via de sinalização das MAP quinases para a realização das análises experimentais. Em C. elegans, a proteína JNK está relacionada ao aumento de longevidade e da resistência aos estresses térmico e oxidativo.

Oligonucleotídeos específicos foram desenhados paraamplificar a região promotora do gene emC. elegansbem como as regiões codificantes(CDS) em ambos os organismos. A região promotora foi amplificada a partir do DNAgenômico extraído deC. elegansadultos. O RNA total foi extraído de esquistossômuloseC. elegansadultos. As CDS foram amplificadas a partir do cDNA sintetizado e osfragmentos de DNA resultantes foram clonados emE. coliDH5α. As construçõesobtidas foram digeridas com enzimas de restrição selecionadas de forma a linearizar ovetor contendo a região promotora e recuperar as CDS. Posteriormente, foramrealizadas subclonagens através da ligação das CDS deC. eleganseS. mansonicom aconstrução contendo a região promotora.C. elegansN2 receberam as construçõesfinais através de microinjeção. Foram obtidas três linhagens que expressam Ce_JNK-1,denominadas N2Ex01[Ce_jnk-1], N2Ex02[Ce_jnk-1]e N2Ex03[Ce_jnk-1]e duaslinhagens expressando Sm_JNK, denominadas N2Ex04[Sm_jnk]e N2Ex05[Sm_jnk].Os níveis de expressão de Sm_JNK e Ce_JNK-1 nas linhagens transgênicas foramavaliados por RT-PCR quantitativo. Apesar do aumento da expressão de JNKobservado nas linhagens transgênicas, não houve aumento na longevidade dasmesmas. Embora esta seja a primeira utilização de expressão heteróloga emC. eleganspara investigar a função de genes deS. mansoni, esta técnica tem sido utilizada comsucesso para nematóides parasitos e pode tornar-se uma abordagem alternativa para osestudos funcionais em outros parasitos